貨號：SC706011
規(guī)格：50測試/盒
【產(chǎn)品概述】
支原體形態(tài)多樣，大小介于細菌和病毒之間，可通過細菌濾器，對一般抗生素不敏感，是細胞培養(yǎng)過程中導(dǎo)致細胞污染的一種常見微生物。支原體污染細胞后，通常會引起細胞形態(tài)和功能的改變，且很難被清除。
本試劑盒針基于qPCR技術(shù)，對支原體屬的保守區(qū)DNA設(shè)計引物探針，對樣品中的支原體DNA進行定性檢測，檢測靈敏度高，特異性好，可檢測的支原體包括萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、雞毒支原體、滑液支原體、螺原體等共計百余種支原體。
（圖1 檢測原理圖）
本試劑盒以DNA探針為底物，當檢品中存在核糖核酸酶時，DNA探針被降解，標記在探針上的熒光基團與淬滅基團分離（詳見圖1），產(chǎn)生熒光，該方法具有操作簡便、準確性高、重復(fù)性好及高靈敏度等優(yōu)點，可根據(jù)需求自由選擇進行定性或定量檢測。
【產(chǎn)品特點】
1. 操作簡單，檢測時間短，2個小時完成檢測。
2. 適用性廣，可用于各種樣本類型的檢測（細菌，細胞沉淀，培養(yǎng)液，細胞制品等）
3. 試劑盒包含內(nèi)參，可對樣本提取至最終上機的全過程實施監(jiān)控，有效預(yù)防假陰性。
4. 檢測過程閉管操作，不受環(huán)境因素影響，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高，無污染風險。
5. 靈敏度高，針對下表中的支原體檢測限低至10 CFU/ml。
6. 支原體種類覆蓋范圍廣，可檢測120余種支原體。
適用支原體種 | ||
精氨酸支原體（M. arginini） | 口腔支原體（M. oral） | 肺炎支原體（M. pneumonia） |
滑液支原體（M. synoviae） | 螺原體（Spiroplasma citri） | 萊氏無膽甾原體（A. laidlawii） |
豬鼻支原體（M. hyorhinis） | 發(fā)酵支原體（M.fermentans） | 雞毒支原體（M. gallisepticum） |
【支原體介紹】
支原體（Mycoplasma）是一種介于細菌和病毒之間的原核細胞型微生物，它沒有細胞壁，由胞外結(jié)構(gòu)、單位膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)組成，最早是在1898年由法國的Nocard及Roux自患牛肺疫的病灶中分離出來的，1967年被正式命名為支原體。
由于缺乏生物合成和代謝能力的基因，支原體必須依賴宿主細胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，支原體的胞外結(jié)構(gòu)中的莢膜和粘附結(jié)構(gòu)可以幫助其粘附在細胞表面或進入細胞內(nèi)部。雖然支原體廣泛存在于自然環(huán)境、人和動物體內(nèi)，但只有少數(shù)支原體對人有致病性。常見的人致病支原體包括肺炎支原體、溶脲脲原體、人型支原體和生殖器支原體等。巨噬細胞、lgG和IgM等宿主免疫因子可以對支原體起到一定的殺傷作用。
(圖2 支原體顯微形態(tài))
【生物制品為什么要進行支原體檢測】
（1）細胞培養(yǎng)中的支原體感染是一個普遍存在的問題：
支原體是一種廣泛分布于自然環(huán)境中的微生物，其大小一般在0.2-0.5微米之間，可以透過一般濾膜，因此在細胞培養(yǎng)過程中，易造成支原體對細胞的感染。自1956年Robinson等首次從三株Hela細胞培養(yǎng)中分離出支原體以來，就不斷有關(guān)于支原體污染細胞的報道出現(xiàn)。在細胞培養(yǎng)中的支原體感染，95%的污染源來自口腔支原體（M. orale），精氨酸支原體（M. arginini），發(fā)酵支原體（M. fermentans），豬鼻支原體（M. hyorhinitis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）。
（2）支原體感染的危害：
支原體感染會導(dǎo)致細胞內(nèi)部環(huán)境的改變，影響細胞的正常生存和功能。嚴重的情況下，會導(dǎo)致細胞死亡或生物學特性的改變。此外，支原體感染會影響細胞對各類激素、藥物和化學物質(zhì)的反應(yīng)，從而干擾實驗的結(jié)果，對實驗結(jié)果造成影響。
細胞是制備疫苗的主要載體之一。支原體通過引起細胞病變，競爭營養(yǎng)和抑制干擾素分泌等機制，產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，干擾病毒復(fù)制，這會極大影響疫苗的產(chǎn)量，并可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫抑制。
此外，在疫苗制造中，常常會將支原體污染帶來的干擾誤以為是病毒繁殖造成的病變效應(yīng)，從而導(dǎo)致虛假的效力測定結(jié)果，影響病毒真正滴度的測定，使研究結(jié)果的真實性和可靠性大大存疑。
因此，針對支原體對細胞培養(yǎng)帶來的巨大不良影響，在中國藥典、歐洲藥典、美國藥典和日本藥典中都要求，對主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批以及病毒疫苗等均需執(zhí)行支原體檢查。其中歐洲藥典和美國藥典更是要求樣品首次執(zhí)行支原體檢查或生產(chǎn)流程變更時需要進行干擾性確認，以保證支原體檢查結(jié)果的有效性。
【支原體的檢測方法】
（1）培養(yǎng)法：
通過提供適合支原體生長的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)支原體。通過對液體培養(yǎng)基的顏色、濁度變化，固體培養(yǎng)基和半流體培養(yǎng)基的支原體菌落形態(tài)來判斷支原體的生長。
（2）熒光指示細胞法：
常見的支原體檢測方法中最簡單、最經(jīng)濟的方法是熒光指示細胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長為420nm。該染料會結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%），所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體DNA，證明該細胞有支原體污染。熒光指示細胞法較為快捷，方法簡單，但其靈敏度有一定的欠缺，易造成漏檢。
（3）掃描電子顯微鏡法：
掃描電子顯微鏡法非常直觀、準確，對使用環(huán)境要求高，操作復(fù)雜，實驗周期較長，常作為樣品的最后定性檢測。
（4）免疫熒光法：
免疫熒光試驗利用支原體的單克隆抗體和熒光標記的二抗識別樣品中的支原體抗原，通過熒光顯微鏡判斷是否存在支原體。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）同樣也是使用支原體的單克隆抗體，利用抗體上的“標簽”蛋白的量來判斷是否存在支原體。該方法靈敏度較低，對低濃度樣品容易造成漏檢的情況。
（5）PCR法：
PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種體外擴增DNA的技術(shù)。PCR技術(shù)利用DNA聚合酶酶學原理，通過一系列的循環(huán)反應(yīng)，將靶DNA模板擴增出數(shù)萬億份相同的DNA片段，放大檢測標的，達到特異性檢測的目的。PCR法檢測支原體的方法最為快速、靈敏。取樣量少，既可做細胞本身，也可做細胞培養(yǎng)液上清的檢測，同時可以檢測多種支原體的污染，是目前常用的檢測手段，也是歐洲藥典中提到的檢測方法。
【應(yīng)用場景】
1）抗體藥、疫苗生產(chǎn)過程中的支原體檢測
2）科研實驗室細胞培養(yǎng)的支原體檢測
【應(yīng)用單位】
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